Por: Gerardo Jair Jaime González
Lo primero que debemos de tomar en consideración para realizar el procedimiento pertinente de identificación humana mediante ADN, es la verificación del levantamiento, empaque y/o embalaje, así como las condiciones de traslado de la muestra; esto para descartar que la muestra se haya contaminado, alterado o destruido y, por ello, se haya degradado el material genético, recordando que éste se puede encontrar en sangre, saliva, semen, tejido blando, tejido ósea, manchas o células epiteliales.
Después de dicha verificación se procede a realizar la extracción, la cual es el proceso de separar el ADN del resto de los componentes internos de la célula; en virtud de que el ADN no se encuentra totalmente sólo en el núcleo de las células, se aplica una lisis diferencial de tipo iónico; esto es adicionar detergente, con el objetivo de ir lisando la pared celular y diferencial de centrifugación; este proceso se le conoce como “lavado”, el cual se va repitiendo para seguir degradando de manera diferencial iónica y centrifugación, hasta llegar al núcleo y después ir degradando las proteínas provenientes del núcleo, hasta obtener el ADN de alto peso molecular y pureza, para no afectar el proceso de PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Para comprobar la pureza, se realiza un lavado con una solución de cloroformo impregnado con fenol, para eliminar algún resto de proteínas, se mezcla perfectamente en un mezclador tipo vortex y se separa la fase acuosa, de la orgánica por medio de centrifugación. Se adiciona un volumen igual al de la fase acuosa, (que es la útil pues es ahí donde se encuentra disuelto el ADN) de etanol absoluto frío el cual precipita al ADN. El etanol lo desplaza, ya que este es más soluble en agua que el ADN.
Acto seguido, se procede a cualificar y cuantificar a través de electroforesis horizontal, que consiste en preparar una gelatina de un grosor de 0.6 cm y con una superficie de 14 cm de largo por 11 cm de ancho. Esta gelatina se prepara con agarosa grado proteínas, con una concentración que va del 0.8% al 1.0%, esta concentración permite desplazar el ADN, a través de los sitios activos de la agarosa. El desplazamiento debe ser únicamente de 1.5 cm, a partir del origen, pues si rebasa esa medida no se puede cualificar si es o no de alto peso molecular, puesto que se lleva a cabo un barrido en el que no se observa una sola banda. Una banda bien definida a esa distancia, aseguran un ADN, de alto peso molecular.
Para cuantificar el ADN en la muestra, se puede proceder de dos formas: la primera se efectúa preparando gel de agarosa, en donde se colocan estándares de peso molecular conocido de 50, 100, 250 y 300 ng (nanogramos por cada 10 microlitros uL) y de acuerdo con la intensidad de la banda, se extrapolan con las bandas obtenidas de la muestra problema, determinando así la concentración del material genético. La segunda forma, se realiza mediante espectroscopía de luz ultravioleta. Las absorbencias que lo caracterizan son de 260 y 280, para determinar la pureza y la concentración del material genético.
Después de cuantificar, se toman en promedio de 2 a 8 nanogramos de ADN para llevar a cabo la PCR, la cual es un tipo de clonación, ya que se generan copias exactas de un fragmento especifico, de algún oligonucleótido del genoma humano y de naturaleza polimórfica, esto es que tiene un alto índice de variabilidad y puede diferenciar a individuos muy parecidos. La PCR tiene en promedio 30 ciclos y cada ciclo se obtiene a diferente temperatura. Estas temperaturas dependen de los “primers” o cebadores; éstas se refieren a una secuencia de oligonucleótidos específica, que son, el o los moldes que generan el fragmento que se quiere amplificar.
La primera temperatura utilizada es de 90°C, donde la doble hélice de ADN se separa en dos hebras de ADN; rompiéndose los enlaces de hidrógeno generando dos cadenas de ADN. La segunda temperatura es de 60°C, momento en que los “primers” o cebadores, se pegan a cada fragmento de ADN y la última temperatura, se eleva a 70°C, en donde la enzima Taq polimerasa, comienza a colocar, de acuerdo a la secuencia de los “primers”, cada base púrica y piridímica, generando a partir de una doble hélice, 2 hélices de ADN; de dos se obtiene 4 y así sucesivamente hasta complementar en promedio, 30 ciclos, los que generan millones de secuencias en cuestión.
Al concluir los ciclos programados, el producto amplificado es sometido a una temperatura final de 72°C, por 7 minutos, con la finalidad, de asegurar la unión de las cadenas de ADN formadas. Los factores que pueden afectar la amplificación son: la pureza del ADN, la concentración de éste y la temperatura de amplificación.
Por último, al concluir la Reacción en Cadena de la Polimerasa, se elabora un gel de agarosa grado PCR al 4% dependiendo de la muestra y para verificar la presencia de ésta, deberá aplicarse al gel, la llamada “escalera de peso molecular”, para determinar con precisión los productos de PCR. Una vez hecho lo anterior se determinará el genotipo de la muestra, lo que puede lograrse utilizando cualquiera de los siguientes procedimientos: el primero es por medio de tiras Dolt-Blot, y el segundo consiste en efectuar electrofóresis vertical. Esta técnica es más sensible que la anterior.
Cabe mencionar que este procedimiento es sólo uno de los que se puede aplicar en los diferentes laboratorios de genética forense instalados en las Fiscalías y/o Procuradurías de los estados y de la Federación.
Bibliografía:
- Franco de Ambriz, M. Hematología forense y otras técnicas serológicas. Editorial Porrúa. México.
- Richard Li. Forensic Biology. CRC Press.
- Rostand, J. Introducción a la Historia de la Biología. Artemisa, S.A. de C.V. México.
